pcr扩增各个试剂的作用(pcr扩增产物的方法)
pcr扩增产物的方法
所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，DNA聚合酶的失活,dNTP和引物的枯竭，反映副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
pcr扩增的试剂
扩增子（amplicon）为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列。比如通过PCR扩增得到的某个基因的扩增片段。
更简单地说，扩增子是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。
中文名 扩增子
外文名 amplicon
简介 为基因组的一个DNA片段
来源
经过人工扩增的DNA片段或RNA片段
类别 扩增产物
pcr扩增产物的方法有几种
PCR是聚合酶链式反应的简称，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火、适温延伸等反应组成1个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。
具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断和任何有DNA和RNA的地方。
PCR扩增产物是什么
答：检测相同基因在不同样本中表达量的差异。
解释：qrt-pcr又叫实时荧光定量pcr，一般在起始反应模板中，总得基因的量是一样的，在扩增过程中由于所有条件都是一致的，当不同样本中目的基因有差异时，随着扩增循环数的加大，不同样本中目的基因到达设定的阈值得循环数就回有差异，通过计算不同样本中的循环数可以判断目地基因在不同样本中的表达量（表达差异）。
pcr扩增产物的方法有哪些
这个是分子生物学实验中的常规技术方法，PCR扩增产物一般为双链DNA片段，在加有TBE缓冲液的琼脂糖凝胶中DNA分子带负电荷，因此在电泳过程中DNA分子会从阴极向阳极泳动，分子量大的DNA分子会比分子量小的DNA分子移动速度慢，从而实现不同分子量DNA片段的分离，电泳结束后用特异性核酸染料溴化乙锭染色，在紫外光照射下显示不同的条带。
pcr扩增产物的方法主要有
合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）(又称：多聚酶链式反应)PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
PCR扩增产物
因为PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片段才能通过T/A配对进行连接。通过PCR的方法扩增目的基因片段的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片段通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：
（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。
pcr怎样才能得到较好的扩增产物
其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，需优化PCR条件。
常用于PCR产物的标记，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段DNA maker是一种分子量已知的几种片段的混合物，在电泳时可以标定目标片段的分子量大小，当出现一条带并且大小与预期一致时可认为片段正确，使DNA片段在数量上呈指数增加，反之，当大小不一致或者有多条片段时，是在模板DNA。PCR是一种体外DNA 扩增技术，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环。当DNA maker用于标定基因组DNA时常用于原核生物基因组或质粒等单一组分的分子量预测 PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下
pcr扩增产物的分析方法有哪些
实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
检测指标是：各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
原理：
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
PCR扩增产物分析的方法
1. 试剂准备阶段
试剂准备是 PCR 操作的第一个流程，需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的 PCR 体系都应该在 - 20℃ 保存，除了 ddH 2 O 之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行 PCR 反应。
2. 样本制备阶段
样本制备是整个 PCR 反应中最为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。
所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，注意生物安全柜中物品的排放。戴手套并勤于更换，要有「无核酸观念」 。
3. 核酸扩增
在核酸扩增环节需要选择质量好的 Ep 管，装入反应体系的 EP 管上机前混匀、离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。同时严密检测 PCR 扩增仪的各项性能指标，其中对 PCR 扩增仪而言温度控制就意味着质量。
4. 产物分析
常见问题：
1）无 CT 值出现：模板量不足（杂质的引入及反复冻融的情况等）
2）CT 值出现过晚（大于 38）：各种反应成分的降解或加样量的不足
3）标准曲线线性相关性不佳：加样误差、标准品出现降解等
4）阴性对照有信号：模板有基因组的污染
5）扩增效率低：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制
6）扩增曲线的异常：模板的浓度太高或荧光染料的降解
四、实验室操作环境的维护
1） 各工作区要有一定的隔离，进入工作区域应按照单一的方向进行。试剂贮存和准备区 → 标本制备区 → PCR 扩增区 → 产物分析区单一方向进行。
2） 各个区域实验用品专用：各个区域实验设备和物品应有明确的标记，不能混用。
3） 实验场所要保持通风良好，严格监测各个工作区的温湿度。
4）注意实验室污染的预防。
整个 PCR 实验的操作都需要特别注意避免污染，来自样本的、试剂的以及实验室各种气溶胶，要始终保持「无核酸观念」。
PCR扩增的原料
一、基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
二、PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。